Tfx™-10, Tfx™-20 和 Tfx™-50 试剂转染真核细胞
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一些常见问题： |
| 1) 什么是 Tfx™-10, Tfx™-20 和 Tfx™-50 试剂？ Tfx™试剂的一般用途是什么？ |
| 2) Tfx™试剂如何工作？ |
| 3) 用哪类试剂对哪类细胞株作了有效转染？ |
| 4) 用 Tfx™试剂能成功转染悬浮细胞吗？ |
| 5) Tfx™试剂能用于制备稳定转染细胞株吗？ |
| 6) 在第一次使用试剂转染一个特定的细胞株时，需对哪些因素作优化？ |
| 7) 电荷比如何？什么是优化的好的起始指标？ |
| 8) DNA 如何影响转染？什么是优化的好的起始指标？ |
| 9) 脂 -DNA 混和物与细胞接触有多长时间？什么是优化的好的起始指标？ |
| 10) 转染培养基含有血清吗？ |
| 11) 不需对转染指标作优化，什么是使用 Tfx™试剂的好的起始指标？ |
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1) 什么是 Tfx™-10, Tfx™-20 和 Tfx™-50 试剂？ Tfx™试剂的一般用途是什么？
Tfx™试剂是合成脂混和物，由阳性脂分子（ N, N, N', N'- 四甲基 -N, N'- 双（ 2- 羟乙基） -2,3— 双（油酰氧） -1,4- （碘化丁二胺），和 DOPE （ L- 双油酰磷脂酰乙醇胺）形成的干脂膜。将 Tfx™试剂溶于蒸馏水后，用于将 DNA 转染到真核细胞中。所有 Tfx™试剂中阳性脂成份的浓度相同，但 DOPE ：阳性脂的摩尔比作了调整。不同的脂配比，导致不同的 Tfx™试剂对不同的细胞株转染最有效。 |
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2) Tfx™试剂如何工作？
Tfx™试剂中的阳性脂带有的正电荷头部基团通过酯键与脂分子骨架相连。正电荷头部基团与带负电荷的核酸相结合，形成多片层颗粒。通过脂分子骨架与细胞膜相互作用，颗粒中的核酸有效地转入细胞中。 |
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3) 用哪类试剂对哪类细胞株作了有效转染？
不同的 Tfx™试剂对不同的细胞株转染最有效。对一个细胞株使用哪种转染试剂最有效，需通过实验来确定， Tfx™试剂转染盒（目录号 E2400 ）为这种选择提供了各类 Tfx™试剂样品，转染辅助网叶提供了用 Promega 公司的转染试剂成功地转染细胞株的转染条件。 |
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4) 用 Tfx™试剂能成功转染悬浮细胞吗？
用 Tfx™试剂成功地转染了几种悬浮细胞。转染悬浮细胞的条件与转染附着细胞一样，需作优化。 |
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5) Tfx TM 试剂能用于制备稳定转染细胞株吗？
是。用有效地获得瞬时表达的条件转染细胞株，制备了几种抗药细胞株。比如，将带有新霉素磷酸转移酶基因（ NPT ）的 pCI-neo 载体（目录号 E1841 ）转染到细胞中，用 G-418 抗菌素（目录号 V7981 ）筛选表达 NPT 基因的细胞。 |
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| 6) 在第一次使用试剂转染一个特定的细胞株时，需对哪些因素作优化？
当首次使用 Tfx™试剂时，可对 5 个主要的因子作优化：
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脂对 DNA 的电荷比
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所用 DNA 的量及纯度
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细胞接触脂 -DNA 混合物的时间长度
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血清的效果
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所用的 Tfx™试剂
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7) 电荷比如何？什么是优化的好的起始指标？
电荷比指的是 Tfx™试剂的正电荷与 DNA 磷酸基团的负电荷的比值。总的正电荷必需超过总的负电荷。这使与 DNA 结合的多片层颗粒带正电荷，这有利于脂 /DNA 复合物与靶细胞表面带负电荷的膜相互作用。电荷比从 2 ： 1 到 4 ： 1 （ Tfx TM 电荷： DNA 电荷）适用于培养的细胞，其他比值对其他的细胞类型或用途有效。 2 ： 1 电荷比相当于 3 μ l 的 Tfx TM 试剂 (400 μ l/ 管 ) 每 μ g 质粒 DNA 。 |
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| 8) DNA 如何影响转染？什么是优化的好的起始指标？
DNA 纯度和浓度是重要的因素。质粒必须不含残留蛋白， RNA 及化学试剂。用大多数销售的过柱方法提取的质粒会有残留的内毒素。内毒素是大肠杆菌及其他革兰氏阴性细菌外细胞膜的多脂多糖主份（ LPS ）。一些细胞株较其他细胞株对质粒样品中的内毒素更敏感。在一些条件下，残留内毒素使细胞株用任何一种转染试剂的转染效率降低。用一些方法可有效减少残留内毒素，比如用氯化铯密度超离心或用 WizardPurefection 质粒 DNA 纯化方法。
所用 DNA 的最适量取决于 DNA 的类型及转染的特定的 DNA 。将乙醇沉淀的 DNA 溶于水或 TE 缓冲液中，终浓度为 0.2-1mg/ml 。比如用 24 孔板培养的 HeLa 细胞用 Tfx™-20 试剂将 0.25 μ gpGL3 对照 DNA 成功地转染。 NIH/3T3 细胞用 Tfx™-50 试剂将 1 μ g 同样 DNA 成功地转染。建议用 0.25,0.50,0.75,1 μ gDNA 对 24 孔板培养的附着细胞进行转染。增加转染 DNA 的量不一定导致更高的转染效率。 |
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9) 脂 -DNA 混和物与细胞接触有多长时间？什么是优化的好的起始指标？
用 Tfx™试剂的接触时间较其他阳性脂的时间短。 Promega 公司对细胞株所作的测试表明有效的脂接触时间为 1 到 2 小时，但接触时间需依特定的细胞类型与 DNA 而改变，需测试从 0.5 到 4 小时的接触时间的效果。 |
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10) 转染培养基含有血清吗？
转染培养基中含血清的效果不是很确定，需作实验。大多数细胞在无血清时转染最有效，但一些细胞如 HepG2 和 COS-7 ，在有血清时转染更有效。 |
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11) 不需对转染指标作优化，什么是使用 Tfx™试剂的好的起始指标？
Promega 公司极力建议优化 Tfx™试剂的转染因素，最先，实验改变转染 DNA 的量（ 0.25,0.50,0.75,1ugDNA 每孔 /24 孔板），电荷比为 Tfx™试剂： DNA 为 3 ： 1 。转染可用附着细胞，无血清转染，接触时间为 1 小时。在一个 24 孔板中测试各种 Tfx™试剂（每一个 DNA 浓度重复 6 次），一旦确定最佳 DNA 的浓度，可进一步改变电荷比（ 2 ： 1 和 4 ： 1 ）和时间。 |
