pTARGET哺乳表达载体系统
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一些常见问题： |
| 1) 什么是pTARGET载体？它是否以pGEM-T为基础？ |
| 2) 使用pTARGET载体是否会影响目的基因的表达水平？ |
| 3) pTARGET载体具有什么特征以维持高表达？ |
| 4) 对插入片段有何要求？ |
| 5) 测序应用什么引物？ |
| 6) 具有修复功能的DNA聚合酶如Tli产生的产物能否克隆到pTARGET载体上？ |
| 7) 用Access RT-PCR产生的PCR产物能否克隆到pTARGET载体上？ |
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1) 什么是pTARGET载体？它是否以pGEM-T为基础？
pTARGET载体用于克隆PCR产物，并将克隆的产物在哺乳细胞中表达。pTARGET载体以pCI-neo哺乳细胞表达载体系统为基础，用 Eco RV酶切，并加3`-T，和对pGEM-T（A3600，A3610）载体的处理方法相似。pTARGET载体和pCI-neo哺乳细胞表达载体系统的主要区别，是有 lac Z的alpha肽段（在指示平板上作蓝/白斑筛选）和克隆位点的T凸头。 |
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2) 使用pTARGET载体是否会影响目的基因的表达水平？
设计pTARGET载体是为获得基因在哺乳细胞中的高表达。对 lac Z的alpha肽段作了许多修饰，使它对表达插入片段不产生负面影响。MCS5`上游和3`下游的剪切位点都被除去。修饰了可能使转录RNA产生发卡结构的序列（降低翻译水平）。为了确认改进的效果，比较了5个报告基因在pTARGET载体和pCI-neo的表达。4个报告基因在两载体上的表达量相当。 lac Z基因在pTARGET载体上的表达较低，可能是alpha肽段序列和belta-gal基因转录的mRNA相互作用的结果。 |
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3) pTARGET载体具有什么特征以维持高表达？
载体带有CMV的早早期增强子/启动子，SV40增强子/早期启动子，在CMV区域的下游和SV40晚期polyA信号区的下游有一个嵌合的内含子。CMV的早早期增强子/启动子保证在多种细胞类型中获得高的组成型表达。SV40早期启动子驱动新霉素磷酸转移酶的表达，用G418筛选可获得稳定转染株。SV40早期启动子带有SV40的复制起始区，可在带有SV40大抗原的细胞株中（COS-1，COS-7细胞）使载体瞬时复制。在cDNA的一端带有内含子，有利于大多数cDNA的高表达，高表达的程度取决于克隆的基因。SV40晚期polyA信号区在转录RNA的下游形成polyA，咳增加RNA的稳定并维持RNA的量，提高蛋白的表达水平。 |
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4) 对插入片段有何要求？
5`端具有ATG作为翻译的起始密码子，而且必须是插入片段5`端的第一个ATG。与起始ATG相邻的密码子组成会影响翻译的效率。表达序列应带终止密码子，载体上无终止密码子。 |
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5) 测序应用什么引物？
用Promega公司的T7启动子引物（目录号Q5021）测序。由于alpha肽段编码序列的改变，pUC/M13引物不适用。 |
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6) 用具有修复功能的DNA聚合酶如 Tli 产生的产物能否克隆到pTARGET载体上？
成功克隆到载体上的插入片段，要求插入片段的3`末端带有一个单核苷酸凸头。带有3`-5`外切核酸酶的酶（修复功能）产生平末端，需在PCR扩增后加单核苷酸。可在最后一轮循环反应中添加dATP和TaqDNA聚合酶，或在PCR反应完成后加。 |
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7) 用Access RT-PCR系统产生的PCR产物能否克隆到pTARGET载体上？
Access RT-PCR系统用 Tf 1DNA聚合酶，它不具有修复功能，产生A凸头的产物。产物不需进一步修饰可直接克隆pTARGET载体上。
1. Brondyk, B et al (1996) Promega Notes58, 2
2. Kozak, M (1989) J Cell Bio. 108,229
3. Kobs G (1996) Promega Notes55,28
4. Zhou, M Y.,Clark, S E and Gomez-Sanchez C E (1996) Biotechniques19,34. |
