MAPK细胞信号产品
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一些常见问题： |
| 1) Promega有哪些和MAPK细胞信号相关的抗体？ |
| 2) 什么是Anti-ACTIVE抗体？ |
| 3) 为什么用Anti-ACTIVE抗体？ |
| 4) 与Anti-ACTIVE抗体配套的次级抗体是什么？ |
| 5) Anti-ACTIVE抗体是否有对照抽提物？ |
| 6) MEK抑制剂U0126是什么？与PDO98059相比如何？ |
| 7) U0126如何用？ |
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1) Promega有哪些和MAPK细胞信号相关的抗体？
Promega公司有几种抗体，研究细胞分裂素激活的蛋白激酶（MAPK）细胞信号途径。Anti-ACTIVE-MAPK和Anti-ACTIVE- JNK抗体（目录号V8031， V7931）经专门设计，分别测定活化的双磷酸化形式的MAPK（ERK1，ERK2）和JNK。Anti-ERK1/2pAB ，兔（目录号V1141），是一个全抗体，既可识别磷酸化也可识别非磷酸化形式的ERK1和ERK2。Anti-pT183 MAPK pAb(目录号V8081)特异地识别磷酸化的ERK1/2，磷酸化的位点是ERK1和ERK2催化核心TEY模体中的苏氨酸。 |
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2) 什么是Anti-ACTIVE抗体？
MAPK和JNK酶在催化结构域的`磷酸化环`都含有Thr-X-Tyr共有序列（见表1）。只有当序列中苏氨酸和酪氨酸同时被磷酸化后，MAPK和JNK才具有活力。Promega公司的Anti-ACTIVE抗体来自抗这个磷酸化的肽核心序列，特异地识别活化的、双磷酸化的MAPK和JNK。Anti-ACTIVE抗体经过两步纯化。首先，兔血清通过含非磷酸化肽段的柱子，随后在带有活化激酶相关的双磷酸化肽段的柱子上进行亲和层析。纯化的抗体和单磷酸化或非磷酸化的蛋白，及这个超级家族的其他成员间无交叉反应。
表1 Promega公司的Anti-ACTIVE抗体识别双磷酸化的核心序列
Anti-ACTIVE抗体MAPK： 催化核心pThr183-Glu184-pTyr185
Anti-ACTIVE抗体JNK：催化核心pThr183-Pro184-pTyr185
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3) 为什么用Anti-ACTIVE抗体？
Promega公司的Anti-ACTIVE抗体在Western印迹中，对细胞粗提液有效，因而提供了一个简单、非放射地测定活化激酶的方法。Anti-ACTIVE抗体可取代其它方法测定活化激酶，比如电泳迁移率变迁测定、胶内激酶测定、免疫沉淀为基础的激酶测定，及用抗磷酸化酪氨酸抗体作的Western印迹。Anti-ACTIVE抗体带有用于Western印迹的完整的操作手册（Anti-ACTIVE-MAPK和-JNK多克隆抗体，Anti-ACTIVE标化的次级抗体偶联物，技术手册TB262） |
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4) 与Anti-ACTIVE抗体配套的次级抗体是什么？
Promega公司的Anti-ACTIVE抗体是来源于兔血清的多克隆抗体。因此测定需用抗兔的IgG次级抗体。为了确定次级抗体所带来的背景信号，需作只有二级抗体的对照实验。Promega公司和Anti-ACTIVE抗体配套的次级抗体是驴的抗兔IgG辣根过氧化酶偶联物，和碱性磷酸酶偶联物（目录号V7951，V7971）。Anti-ACTIVE标化的抗体偶联物和Anti-ACTIVE抗体的特异反应好，背景低，适用于对细胞抽提物的Western印迹作化学发光或分光光度测定。它们和其它来源的IgG的交叉反应低。 |
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5) Anti-ACTIVE抗体是否有对照抽提物？
Promega公司推出了正对照的抽提物，用在Western印迹中测定Anti-ACTIVE抗体。抽提物来自PC12细胞（大鼠嗜铬细胞瘤）。用神经生长因子（NGF）刺激PC12细胞，ERK1和ERK2双磷酸化，可用Anti-ACTIVE-MAPK在Western印迹中测定。一般建议加2.0ug的经NGF刺激的PC12细胞抽提物（目录号V8110），以便用Anti-ACTIVE-MAPK检测时观察到反应信号。山梨醇处理的PC12细胞（渗透应激）表达活化的JNK1和JNK2，可用作Anti-ACTIVE-JNKpAb的正对照。一般加10 ug的经山梨醇处理的PC12细胞抽提物（目录号V8100），用Anti-ACTIVE-JNKpAb测定。用NGF或山梨醇处理的PC12细胞抽提物，都带有未经处理的PC12细胞抽提物用作负对照。 |
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6) MEK抑制剂U0126是什么？与PDO98059相比如何？
MAP激酶的激酶（MEK1，2）负责ERK1和ERK2的激活。MEK抑制剂U0126（目录号V1121）是一个新的、可选择、有效的MEK抑制剂。U0126是一个有机物（1，4-二氨基-2,3-氰基-1,4-双[2-氨基苯基硫代]丁二烯，MW426.5）,与MEK非竞争结合，抑制活化酶的催化活力，而阻制ERK的磷酸化。MEK抑制剂PDO98059，阻制Raf对MEK的活化。PDO98059和非活化的MEK结合，阻制Raf对MEK的活化 。PDO98059对活化的MEK无作用。因此，无论MEK1/2的活化状态如何，U0126会抑制下游ERK1/ERK2的活化。无论离体或活体，U0126比PDO98059的抑制活力高。在体内，U0129组合型地抑制活化的MEK2的IC50为0.07ng, PD098059的抑制IC50为5.00ng，并依激酶和细胞类型而定。 |
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7) U0126如何用？
U0126是小管冷冻干粉，将它溶于10mM234ul的DMSO中。DMSO对有些细胞有毒，可用甲醇（10mgU0126/ml甲醇）替代DMSO。在细胞培养液中用的U0126的浓度为10-50 ng，具体取决于应用和细胞类型。 |
