ISOQUANT 异天冬氨酸检测系统（HPLC和放射性）
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一些常见问题： |
| 1) ISOQUANT 异天冬氨酸检测系统有什么用途？ |
| 2) 什么条件导致产生异天冬氨酸？ |
| 3) 在什么位点产生脱酰氨反应，ISOQUANT 异天冬氨酸检测系统（HPLC和放射性）能检测所有的脱酰氨反应吗？ |
| 4) 什么是PIMT酶？ |
| 5) ISOQUANT 异天冬氨酸检测系统（HPLC和放射性）能检测所有的异天冬氨酸残基吗？ |
| 6) 蛋白的变性或蛋白的酶切能产生异亮氨酸吗？ |
| 7) HPLC和放射性方法各有什么差别？ |
| 8) 用放射性方法时使用者须准备什么材料？ |
| 9) 用HPLC方法时使用者须准备什么材料？ |
| 10) 用HPLC方法时对柱子有什么要求？ |
| 11) 用HPLC方法时的洗脱方案如何？ |
| 12) HPLC方法和放射性方法的灵敏度可比吗？ |
| 13) 从哪儿能获得更多的使用ISOQUANT 异天冬氨酸检测系统（HPLC和放射性）HPLC方法的信息？ |
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1) ISOQUANT 异天冬氨酸检测系统有什么用途？
在肽或蛋白的提取或保存过程中会发生自然的脱酰氨反应。这一系统是用定量或特异的方法测定肽或蛋白的脱酰氨反应的产物。具体可用HPLC和放射性方法测定。 |
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2) 什么条件导致产生异天冬氨酸？
在普通条件下可发生脱酰氨反应，但碱性pH和高温会加速这一过程。大约70%的脱酰氨反应导致产生异天冬氨酸。 |
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3) 在什么位点产生脱酰氨反应，ISOQUANT 异天冬氨酸检测系统（HPLC和放射性）能检测所有的脱酰氨反应吗？
ISOQUANT 异天冬氨酸检测系统（HPLC和放射性）能检测异天冬氨酸产生的过程，可能由于天冬酰氨的脱酰氨反应或由于天冬氨酸异构化为异天冬氨酸。PIMT酶只测定链内的异天冬氨酸，而不能测定多肽链C-端或N-端异天冬氨酸。脱酰氨反应会发生在天冬酰氨或谷氨酰氨位点，以天冬酰氨更普遍（1）。Asn-Gly, Asn-Ser, Asp-Gly最易产生异天冬氨酸，但其它位点也会产生（1，2）。天冬酰氨的脱酰氨反应是氨基酸序列差异和自然降解的主要来源，并是导致中性pH条件下蛋白损伤的主要原因（2，3）。脱酰氨反应会严重影响蛋白多肽的活性和构像，并增加一些蛋白的免疫原性（2，4）。 |
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4) 什么是PIMT酶？
PIMT（蛋白L-异天冬氨酰甲基转移酶）存在在大多数细胞和生物中，是除去异天冬氨酸的主要蛋白。这酶催化甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）转移到异天冬氨酸的羧基上。 |
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5) ISOQUANT 异天冬氨酸检测系统（HPLC和放射性）能检测所有的异天冬氨酸残基吗？
对多数蛋白或肽而言，变性或酶切使PIMT酶接触链内异天冬氨酸残基。一般最好用蛋白酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶）而不是剧烈的化学方法如CNBr处理蛋白，保温时间短（1-2个小时），以限制异天冬氨酸的生成。蛋白酶切可用1mMPMSF终止，这不会影响PIMT活性。最好避免沉淀步骤（丙酮，TCA），这使蛋白的回受率达不到100%。样品可在6-8M的尿素中保温5-10分钟使其变性。终反应中存在1-2M尿素不影响PIMT活性。 |
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6) 蛋白的变性或蛋白的酶切会产生异天冬氨酸吗？
是的，必须检测这些过程（5）。对使用的蛋白酶也必修检测是否存在异天冬氨酸。 |
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7) HPLC和放射性方法各有什么差别？
在放射性方法中，S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸是PIMT反应中的甲基供体，形成3H甲基中间物。加入碱性终止液后，3H以3H-甲醇释放后，被反应管中的海绵捕获，在闪烁液中计数。
HPLC方法检测甲基化反应的附加产物，S-腺苷同半胱氨酸（SAH）。这是一个小分子，很容易从肽中分离，然后用反相高压液相层析定量（RP-HPLC）。 |
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8) 用放射性方法的使用者须准备什么材料？
S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸，闪烁液，闪烁记数仪。 |
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9) 用HPLC方法的使用者须准备什么材料？
RP-HPLC层析试剂和装置。 |
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10) 用HPLC方法时对柱子有什么要求？
用Keystone Scientific, Inc(1-800-437-2999)#255-775-CPG的亲水末端封闭的C-18HPLC柱作水相层析，结果很好。从其他公司购得的同类产品结果可靠。 |
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11) 用HPLC方法时的洗脱方案如何？
用4.6X250mm（5um颗粒）Aquasil C-18柱，附着到贝克曼的HPLC上。溶液A=10mM磷酸钾pH6.2，溶液B=甲醇，样品40ul以流速0.75ml/mg和10%溶液B自动注射（贝克曼126P），随后在15分钟内用25%的B梯度，2.5分钟内用50%的B梯度，随后用10%的B梯度平衡柱子，处理下一个样品。用二级管扫描200-350nm检测（贝克曼168）。在描述的程序中，SAH在注射后15分钟内洗脱出，其它仪器须用纯化的SAH确定。 |
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12) HPLC方法和放射性方法的灵敏度可比吗？
放射性方法的灵敏度为1-5pmol异天冬氨酸，HPLC方法的灵敏度较低（为5-10 pmol异天冬氨酸），如测定的肽与SAH一同洗脱则会受到限制。需将柱子和洗脱方案一同优化以获得最佳灵敏度。 |
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13) 从哪儿能获得更多的使用ISOQUANT 异天冬氨酸检测系统（HPLC和放射性）HPLC方法的信息？
在质量检测网叶上GE1922上可获得有关的资料。
1 Robinson A B and Rudd C J 1974 Curr Top Cell Regul 8, 247
2 Asward D 1994 In : Deamidation and Isoaspartate Formation in Peptides and Proteins CRC Press, Boca Raton, FL
3 Ahern T J and Klibanov A M 1985 Science 228, 1280
4 Liu D T 1992 Trends in Biotech 10, 364
5 Naughton M A et al 1960 Biochem J 77, 149. |
