CytoTox96 非放射测定方法
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一些常见问题： |
| 1) 什么是 CytoTox96 非放射测定方法？ |
| 2) CytoTox96 非放射测定方法的工作原理如何？ |
| 3) CytoTox96 非放射测定方法和其它方法相比有何优点？ |
| 4) CytoTox96 非放射测定方法能否取代 51Cr 释放法？ |
| 5) CytoTox96 非放射测定方法和 51Cr 释放法相比如何？ |
| 6) 应如何保存 CytoTox96 非放射测定方法的组分，保存期是多久？ |
| 7) 不同细胞类型的靶细胞数目是否改变？ |
| 8) 如客户的 ELISA 读数仪的波长不在 490nM 可读，应用什么作为替代波长？ |
| 9) 能将 CytoTox96 非放射测定方法的平板保留后，再读数吗？ |
| 10) 样品能在保存后再分析吗？ |
| 11) CytoTox96 非放射测定方法在什么情况下可替代 CellTiter 96 测定方法？ |
| 12) 如想测定乳酸脱氢酶，能否将 CytoTox96 非放射测定方法作变化后，在单一细胞中测定细胞死亡？ |
| 13) 影响背景读数的因素有哪些？ |
| 14) 应采取何种方法降低靶细胞的自然乳酸脱氢酶的释放值？ |
| 15) 10 × 裂解液的组分如何？ |
| 16) CytoTox96 非放射测定方法在作何种改变后可定量总细胞数？ |
| 17) 哪些参考文献中使用了 CytoTox96 非放射测定方法？ |
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1) 什么是 CytoTox96 非放射测定方法？
CytoTox96 非放射测定方法测定的是细胞死亡时释放的乳酸脱氢酶， CytoTox96 非放射测定方法有多种用途，包括测定：
A ）细胞介导的细胞毒性
B ）由化学及其它因子介导的细胞毒性
C ）总细胞数 |
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2) ytoTox96 非放射测定方法的工作原理如何？
CytoTox96 非放射测定方法是一种比色测定方法，测定的是在细胞死亡时释放的一种稳定的胞质酶—乳酸脱氢酶。 CytoTox96 非放射测定方法可作为 51Cr 细胞毒测试法的替代。用 CytoTox96 测定方法时， 30 分钟的偶联酶测试方法测定培养液上清中释放的 LDH 。该反应将四唑盐（ INT ）转化为红色甲 月替产物。 消减掉合适的背景，颜色的形成和裂解细胞的数目成正比。用 96 孔板读数仪在可见光区读数（ OD490nm ）。
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3) CytoTox96 非放射测定方法和其它方法相比有何优点？
A ）非放射性，不用同位素，不需作放射废物处理
B ）乳酸脱氢酶的定量和铬的释放相关
C ） CytoTox96 非放射测定方法是一种优化的 LDH 测定方法，测定细胞毒性，或总细胞数目的
D ） CytoTox96 非放射测定方法比 51Cr 释放测试法便宜
E ）在可见光区用普通 96 孔板读数仪收集读数 |
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4) CytoTox96 非放射方法能否取代 51Cr 释放法？
是。加上测定应答细胞自发释放的乳酸脱氢酶作为对照，体积校正对照，以及培养液中血清的 LDH 作为对照， CytoTox96 非放射测定方法能取代 51Cr 释放法。 |
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5) CytoTox96 非放射测定方法和 51Cr 释放法相比如何？
在 Promega 及其它地方所作的研究表明 CytoTox96 非放射测定方法和 51Cr 释放法相关，有关的参考文献是：
Decker, T et al. (1988). J. Immuol. Methods 15, 61
Korzeniewske, C et al . (1983) J Immunol. Methods 65, 313 |
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6) 应如何保存 CytoTox96 非放射测定方法的组分，保存期是多久？
底物混合物和测试溶液保存在 -20oC 。重组的底物在 -20oC 保存 6-8 个周不会丧失活力。 LDH 正对照，裂解液（ 10× ），终止液，在 4oC 保存。产品保存期为 6 个月。 |
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7) 不同细胞类型的靶细胞数目是否改变？
是，依细胞类型不同，靶细胞的数目应改变。不同靶细胞中所含的乳酸脱氢酶的量各异。 Promega 建议作预实验，确定用 CytoTox96 非放射测定方法所用的最适靶细胞的数目，以保证有效的信噪比，一般用 5,000-10,000 细胞 / 孔。该用多少淋巴细胞的数目不定，一般应用 2-3 倍的细胞数。 |
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8) 如客户的 ELISA 读数仪的波长不在 490nM 可读，应用什么作为替代波长？
可用波长范围为 470-570nM ，在 490nM 时测试最敏感。
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| 9) 能将 CytoTox96 非放射测定方法的平板保留后，再读数吗？
不能， CytoTox96 非放射测定方法的平板不能保留，必需在一个小时内读数。 |
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10) 样品能再保存后再分析吗？
乳酸脱氢酶（ LDH ）很稳定，如有载体蛋白，样品在保存后可再测试。保存在 4oC 有效，如样品经过冰冻，测试前应平衡到室温。 |
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11) CytoTox96 非放射测定方法在什么情况下可替代 CellTiter 96 测定方法？
CellTiter 96, CellTiter 96 AQ 利用线粒体测定细胞增殖， CytoTox96 非放射测定方法通过乳酸脱氢酶（ LDH ）测定细胞死亡。 CytoTox96 非放射测定方法特别用于在两种细胞类型中测定细胞的死亡。在只有一种细胞时，两个系统均可用于研究细胞死亡， CellTiter 的操作少而且简易。 |
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12) 如想测定乳酸脱氢酶，能否将CytoTox96非放射测定方法作变化后，在单一细胞中测定细胞死亡？
是的， CytoTox96 非放射测定方法能在单一细胞中测定细胞死亡。比如用固定的细胞数目，加不同浓度的测试组分，可进行药物的化学敏感测定。用培养液作为背景对照算作空白。释放的 LDH 量（ 490nm 吸收值，作为 Y- 轴）对应于细胞毒素不同浓度（ X- 轴， log 值）作图。可确定 IC50 值（抑制浓度， 50% 抑制率）。 |
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13) 影响背景读数的因素有哪些？
有多种因素影响 CytoTox96 非放射测定方法。包括：从应答细胞和靶位点中自然释放的乳酸脱氢酶，培养液的血清中所含的 LDH ，酚红，对照校正所有这些因素。动物血清中 LDH 的量变化。牛犊中 LDH 的量最高，以下依次为胎儿牛血清，马血清，及人的 AB 血清。去除酚红，改变血清的钟类，或降低血清的浓度有利于降低背景读数。 |
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14) 应采取何种方法降低靶细胞的自然乳酸脱氢酶的释放值？
乳酸脱氢酶是细胞膜完整性和细胞活性的好的指标，它比锥虫蓝染色灵敏。导致高的靶细胞的自然乳酸脱氢酶释放的原因是测试前的条件。在进行测试前靶细胞的过度生长会使细胞膜 ` 漏 ` 。其它原因包括离心细胞太快，培养液的温度变化范围大， PBS 洗涤液，悬浮细胞时吸液太快等。为使自然释放值低，保持低的细胞密度（ <1.5×10 6 细胞 /ml ） , 新的培养液，离心细胞的速度小于 250g 。 |
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15) 10 × 裂解液的组分如何？
Promega 的 10 × 裂解液是 9%TritonX-100(v/v) 水，这对大多数细胞的裂解有效，有些细胞对去污剂不敏感，将 10 × 裂解液的量从 10ul/100ul 增加到 15 ul/100ul 细胞。 |
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16) CytoTox96 非放射测定方法在作何种改变后可定量总细胞数？
CytoTox96 非放射测定方法在作改变后可定量总细胞数的方法见 Promega Notes Vol45, page11. 。简单而言，加 10 × 裂解液将细胞裂解， 37oC 保温 60 分钟，将 50 ul 上清液加入酶测试平板中，与 50 ul 底物混和。乳酸脱氢酶的转化活力进行 30-50 分钟，加终止液。细胞的数目和吸收值成正比，后者代表乳酸脱氢酶的活力。 |
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17) 哪些参考文献中使用了 CytoTox96 非放射测定方法？
参考文献列在 Product Bibliographs 部分。 |
