CAT酶测试系统及pCAT3载体
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一些常见问题： |
| 1) 什么是CAT酶测试系统？ |
| 2) CAT酶测试方法的工作原理？ |
| 3) 使用CAT酶测试系统有哪些优点？ |
| 4) 氯霉素乙酰转移酶的活力单位如何定义？ |
| 5) 测试试剂能单独购买吗？ |
| 6) 有哪些方法可用于从表达氯霉素乙酰转移酶（CAT）的细胞中制备细胞抽提物？ |
| 7) 报告基因裂解液与蛋白测试方法能相互配合使用吗？ |
| 8) 3H-氯霉素与14C-氯霉素，哪一种同位素更适用于测试方法？ |
| 9) Promega公司有哪些氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因载体？ |
| 10) 载体pCAT3与载体pCAT有何差别？ |
| 11) 什么是载体pCAT3的骨架？ |
| 12) 载体pCAT3上有什么增强子和启动子？ |
| 13) 有哪些细胞株不能同pCAT3载体一同使用？ |
| 14) 如pCAT3对照载体的活力很低，应采取哪些措施？ |
| 15) 载体pCAT3上的转录起始位点位于何处？ |
| 16) 能克隆在载体pCAT3上的插入片段的长度是多少？ |
| 17) 有同pCAT3报告基因载体一同使用的测序引物吗？ |
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1) 什么是 CAT酶测试系统？
Promega公司的CAT酶测试系统有两种方法在转染的细胞中测试氯霉素乙酰转移酶的活力，可用液闪计数（LSC）或薄层层析（TLC）方法。LSC和TLC可平行用于从单个细胞抽提物中完成测试。细胞抽提物与含14C-或3H标记的氯霉素及n-丁酰辅酶A一同保温。氯霉素乙酰转移酶（CAT）将辅酶的n-丁酰基转移到氯霉素上。同位素标记的丁酰基氯霉素可用LSC或TLC方法测试。 |
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2) CAT酶测试方法的工作原理？
氯霉素乙酰转移酶（CAT），由细菌的药物抗性基因编码，在1个或2个羟基位点上乙酰化药物使氯霉素失活（1）。真核细胞无这一基因，故真核细胞内的无CAT背景活力或很低。这一特点及CAT活力测试的方便及灵敏，使CAT报告基因广泛用于研究哺乳细胞基因表达（2，3）。 |
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3) 使用 CAT酶测试系统有哪些优点？
CAT酶测试能在2-3小时内完成，酶活力的线性范围达3个数量级，能检测2pg量的CAT。薄层层析测试方法较液闪计数方法的灵敏度低而耗时长，但可用于目测实验结果。 |
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4) 氯霉素乙酰转移酶的活力单位如何定义？
1单位定义为：1分钟，37oC，在75mMTris-HCl(pH8.0),95ng乙酰辅酶A,0.95ngDTNB,97ng氯霉素中，将1nmol乙酰转移到氯霉素上所需要的氯霉素乙酰转移酶的量。 |
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5) 测试试剂能单独购买吗？
氯霉素乙酰转移酶（CAT）可单独购买（目录号E1051）。n-丁酰辅酶A不单独出售，但可从Sigma或Pharmacia购得锂盐并溶于水。 |
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6) 有哪些方法可用于从表达氯霉素乙酰转移酶（ CAT）的细胞中制备细胞抽提物？
同CAT酶测试系统一同提供的报告基因裂解液（目录号E3971）可用于细胞裂解。这一方法适用于从共转染多个报告基因载体的细胞抽提物中，同时测试CAT，β-半乳糖苷酶，荧光素酶活力。另外也可用冻融法制备抽提物。 |
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7) 报告基因裂解液与蛋白测试方法能相互配合使用吗？
用报告基因裂解液制备的10ul细胞抽提物可用Bradofrd法测试其浓度。作标准曲线时也用报告基因裂解液。不要用Lowry法。但有一些以Lowry法为基础设计的蛋白测试盒能测含去污剂的样品，故能与报告基因裂解液一同使用。去污剂相容的试剂盒是BioRad DC蛋白测试及Pierce BCA蛋白测试。 |
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8) 3H-氯霉素与14C-氯霉素，哪一种同位素更适用于测试方法？
用薄层层析方法时，使用 14 C-氯霉素。用液闪计数测试方法时，两种同位素都可用。 |
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9) Promega公司有哪些氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因载体？
Promega公司有两类CAT报告基因载体：pCAT3与pCAT报告基因载体,每一类各含4个质粒，及pCAT3或pCATBasic（无真核启动子及增强子），Enhancer（SV40早期增强子位于CAT基因的3 '端）,Promoter（SV40早期启动子驱动CAT基因表达）, Control（SV40早期启动子驱动CAT基因表达，SV40早期增强子位于CAT基因的3 ' 端）。 |
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| 10) 载体 pCAT3与载体pCAT有何差别？
报告基因载体pCAT3的骨架作了改进，增强了CAT的表达，及载体的活体稳定性，在进行基因操作时提供了更大的灵活性。特定的改变包括：
1）CAT基因的变化
在CAT基因的5 '加入了Kozak序列（6）可增强翻译的效率。这一序列提高了CAT的表达，并在CAT的5 '端有NcoI位点。NcoI位点是载体内的单一酶切位点。在CAT基因的下游还有单一的XbaI位点，CAT基因内的EcoRI位点从CAT基因内除去，除含SV40启动子和增强子外，pCAT3报告基因的4个载体相同。
2）内含子
pCAT3报告基因载体发展了一个新的嵌和内含子以优化转录表达，但位于CAT基因的5 '端时，这一内含子可使CAT基因的表达较不含内含子提高20倍。在嵌和内含子的两端有HindIII和 NotI位点，用于酶切。
3）Poly(A)信号
报告基因载体pCAT上的SV40早期Poly(A)信号在pCAT3报告基因载体上，换成SV40晚期Poly(A)信号，在pCAT3报告基因载体多克隆位点的上游插入了一个短的合成的Poly(A)信号，以降低报告基因表达的背景，在多克隆位点的上游插入了3个编码阅读框架的终止密码子，进一步降低翻译的背景。
4）f1复制起始区
pCAT3载体的骨架上含f1复制起始区可制备单链DNA用于测序及突变。 |
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11) 什么是载体 pCAT3的骨架？
载体骨架是pUC19，高拷贝，可在大肠杆菌中复制。 |
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12) 载体 pCAT3上有什么增强子和启动子？
载体pCAT3上有SV40的早期增强子和启动子。增强子为两个衔接72bp的重复，启动子为两个衔接21bp的重复，和一个非衔接21bp的重复。 |
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13) 有哪些细胞株不能同 pCAT3载体一同使用？
COS细胞不能同pCAT3及pCAT载体一同使用。COS细胞，经转化含有部分SV40病毒，带有大T抗原，在SV40的复制中发挥作用。在这些细胞中转染有带SV40复制起始区的CAT载体，会造成CAT活力高背景。 |
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14) 如pCAT3对照载体的活力很低，应采取哪些措施？
优化转染,提高转染的效率。也可采用LSC方法测定CAT活力。LSC法比TLC法灵敏10-100倍。 |
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15) 载体pCAT3上的转录起始位点位于何处？
载体pCAT3上的转录起始位点位于185，191，196碱基处。 |
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16) 能克隆在载体 pCAT3上的插入片段的长度是多少？
能克隆在载体pCAT3上的插入片段的长度达7kb。更长的插入片段难于连接及转染。 |
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17) 有同pCAT3报告基因载体一同使用的测序引物吗？
有两个引物用于pCAT3报告基因载体测序：RVprimer3(目录号E4481)用于顺时针测序克隆位点的上游，RVprimer4(目录号E4491)用于反时针测序CAT基因下游,覆盖BamHI及SaI位点。两个引物可用于双链DNA测序，但只有RVprimer4可用于单链测序。
REFERENCES:
1.Shaw W V (1975)Meth Enzymol. 43, 737
2.Cullen B (1987)Meth Enzymol. 152, 684
3.Gorman C et al (1982)Mol Cell Biol2, 1044.
4.Seed B and Sheen J –Y (1988)Gene 67, 271.
5.Rosenthal N (1987)Meth Enzymol 152, 704
6.Kozak M (1989) J Cell Biol !08, 229 |
