β-半乳糖苷酶酶活力测试系统及pSV-β-半乳糖苷酶载体
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一些常见问题： |
| 1) 什么是 β-半乳糖苷酶酶活力测试系统？ |
| 2) β- 半乳糖苷酶酶活力测试系统的一般活力范围？ |
| 3) β- 半乳糖苷酶酶活力测试系统应保存在哪种温度，保存期是多久？ |
| 4) β- 半乳糖苷酶的酶活力单位是如何定义的？ |
| 5) 为什么 β-半乳糖苷酶酶活力测试系统要提供报告基因裂解溶液？ |
| 6) 用荧光素酶细胞培养裂解试剂制备的细胞抽提物是否能用于测试 β-半乳糖苷酶酶活力？ |
| 7) pSV -β-半乳糖苷酶载体是如何构建的？ |
| 8) 载体内 β-半乳糖苷酶的转录起始位点位于何处？ |
| 9) lacZ 的翻译起始位点在载体内位于何处？ |
| 10) lacZ 序列的起始及终止位点位于何处？ |
| 11) lacZ 基因序列上游的氨基酸序列是否影响酶活力？ |
| 12) pSV -β-半乳糖苷酶载体是否含有完整的lacZ基因？ |
| 13) lacY 基因在载体上位于何处？ |
| 14) 如何从 pSV-β-半乳糖苷酶载体上切割pSV-β-半乳糖苷酶基因？ |
| 15) pSV -β-半乳糖苷酶载体是否存在poly(A)区域？ |
| 16) 作原位染色时，如何配 X-Gal溶液？ |
| 17) 如原位染色后的颜色很浅，应再作哪些实验？ |
| 18) 未转染的细胞是否表达 β-半乳糖苷酶？ |
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1) 什么是 β-半乳糖苷酶酶活力测试系统？
用β-半乳糖苷酶对照载体转染细胞后，可用β-半乳糖苷酶酶活力测试系统直接，方便地测试β-半乳糖苷酶酶活力。β-半乳糖苷酶载体可用着阳性对照载体，测试哺乳细胞的转染效率。细胞抽提物与提供的溶液及底物ONPG共保温（硝基苯吡喃半乳糖,o-nitrophyl-B-D-galactopyranoside）。用分光光度计或ELISA读数仪测定光度数。应在420nm处测定吸收。 |
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2) β- 半乳糖苷酶酶活力测试系统的一般活力范围？
用分光光度计，β-半乳糖苷酶酶活力的标准曲线的范围是0到9个毫单位。用ELISA读数仪，β-半乳糖苷酶酶活力的标准曲线的范围是0到5个毫单位。 |
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3) β- 半乳糖苷酶酶活力测试系统应保存在哪种温度，保存期是多久？
酶应保存在4oC，β-半乳糖苷酶在-20oC冰冻后，会失活。碳酸钠应在室温保存。2×测试溶液应保存在-20oC。如操作得当，系统所有组份从购买之日起在12个月内有效。 |
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4) β- 半乳糖苷酶的酶活力单位是如何定义的？
1个单位的β-半乳糖苷酶的酶活力定义为：每分钟，37oC, pH7.5时，水解1微摩尔的ONPG成硝酸苯酚及半乳糖。 用银染序列DNA测序系统需要额外的装备吗？
额外的装备包括：
热循环仪、SigmaCote溶液（Sigma 目录号SL-2）、无核酸酶的纯水（目录号P1193）、 冰乙酸、震荡器和旋转平台、比测序胶大的聚乙烯盒。 |
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5) 为什么 β-半乳糖苷酶酶活力测试系统要提供报告基因裂解溶液？
报告基因裂解溶液可使β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶（CAT）及荧光素酶的测试能用一种细胞抽提物完成。在多种细胞株中的测试表明，β-半乳糖苷酶在报告基因裂解液中的活力比用冻/融法制备的抽提物的活力更高。 |
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6) 用荧光素酶细胞培养裂解试剂制备的细胞抽提物是否能用于测试β-半乳糖苷酶酶活力？
可以用细胞培养裂解试剂（CCLR）制备的细胞抽提物测试β-半乳糖苷酶活力。但Promega公司推荐，当样品溶在1×CCLR中时，使用1MTris作为终止溶液，如用提供的碳酸钠可导致沉淀。 |
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7) pSV -β-半乳糖苷酶载体是如何构建的？
pRSV-β-半乳糖苷酶载体经修饰成为pSV-β-半乳糖苷酶载体。SV40启动子序列取代了RSV序列，pUC18序列取代了pBR322序列。有关的参考文献见Rosenthal,N (1987) Meth. Enzymol. 152, 704。 |
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8) 载体内β-半乳糖苷酶的转录起始位点位于何处？
转录起始位点位于354,360,365碱基处。 |
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9) lacZ 的翻译起始位点在载体内位于何处？
编码框内的lacZ的翻译起始位点位于500，530，569碱基处，主要的起始位点位于569碱基处。 |
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10) lacZ 序列的起始及终止位点位于何处？
LacZ基因序列起始于710碱基处，但在该序列的上游有其他的氨基酸。lacZ序列终止在3755碱基处。 |
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11) lacZ 基因序列上游的氨基酸序列是否影响酶活力？
不，上游的氨基酸序列对β-半乳糖苷酶的活力无影响。 |
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12) pSV -β-半乳糖苷酶载体是否含有完整的lacZ基因？
β-半乳糖苷酶N-端的6个氨基酸缺失，蛋白起始于第7个氨基酸。缺失的氨基酸不影响酶活力。 |
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13) lacY 基因在载体上位于何处？
LacY的起始密码子AUG位于3809bp，无编码框内的终止密码子，lacY与下游的SV40序列相连接，该序列包含有poly(A)序列。 |
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14) 如何从pSV-β-半乳糖苷酶载体上切割pSV-β-半乳糖苷酶基因？
质粒用HindIII切割基因的上游，BamHI ，SalI， PstI I切割基因的下游。 |
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15) pSV -β-半乳糖苷酶载体是否存在poly(A)区域？
poly(A)信号位于4021bp到4156bp的区域内，在lacZ，lacY基因的下游，但在BamHI的上游。poly(A)信号来源于SV40小T抗原。这一区域与β-半乳糖苷酶的稳定性无关，但可以有助于在哺乳细胞中增强β-半乳糖苷酶mRNA的稳定性。 |
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16) 作原位染色时，如何配X-Gal溶液？
首先加入2%X-Gal（DMF），再加入用PBS（137mMNaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na 2 HPO4, 1.47mM KH 2 PO4）配制的2mMMgCl 2 , 5mMK 4 Fe(CN) 6 .3H2O, 5mMK 3 Fe 3 (CN) 6 ，加入K 4 Fe(CN) 6 后会产生沉淀，这不会影响活力，如有沉淀发生，则过滤除去沉淀。 |
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17) 如原位染色后的颜色很浅，应再作哪些实验？
细胞在X-Gal溶液中应保温更长的时间，不同的细胞染色的特点不同。固定的步骤也可通过增加或减少戊二醛处理的时间，将戊二醛的浓度降到0.05%。一般细胞为浅蓝色，而阳性对照为深蓝色。 |
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18) 未转染的细胞是否表达β-半乳糖苷酶？
是，必须用非转染的细胞作为阴性对照，非转染的细胞也会生色。 |
