GenePlex PowerPlex™ 16
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一些常见问题： |
| 1) 所加模板的最佳量为多少？ |
| 2) 在次系统中能使用 FTA 纸吗？ |
| 3) PP16 系统中热循环有无特别之处？ |
| 4) 为何使用去离子甲酰胺？ |
| 5) 建样品表时是否应包含特别信息？ |
| 6) 进样最佳时间？ |
| 7) 为什么样本基线升高了？ |
| 8) 在 377 胶上有红色背静条纹，为什么？ |
| 9) 每个样本中都有一个低峰？ |
| 10) 在 CXR Ladder 中有额外的峰，为什么？ |
| 11) 当处用 GenePrint Powertyper 16 Macro 时，为什么会有“无足够记忆”的错误？ |
| 12) 在 PowerTyper 中分析数据时无 ILS 数据？ |
| 13) PowerTyper 未为可见峰作分型标记？ |
| 14) Ladder 中的等位基因未被标出？ |
| 15) 为什么会有“ off ladder alleles”？ |
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1) 所加模板的最佳量为多少 ？
我们推荐每个反应用 0.5-1ng 的 DNA 模板。当加量更多时，就会出现位点与位点间峰高的不平衡。通常，小位点比大位点的扩增产物多。将扩增程序中的循环减少 2-4 个可以改善位点与位点间的平衡，推荐扩增时使用小模板量。
应考虑所加模板。推荐模板体积低于终反应体积的 20% ，这是由于样品中可能含有扩增反应的抑制剂。例如，若样品存在于 PH7.5 的 TE 中，所加样品会改变反应体系的 PH 值，这对 TAQ 酶的活性会有影响。另外， EDTA 量的增大会獒合更多的 Mg2+, 使聚合反应活性降低。 |
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2) 在次系统中能使用 FTA 纸吗？
使用 FTA 纸会使 PentaE 与 PentaD 比其它位点的峰低。其它更进一步的研究有待开展。 |
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3) PP16 系统中热循环有无特别之处？
PP16 系统适合于 GeneAmp Model 9600 热循环仪扩增。在技术手册（ TMD012 ）中也包含 PE Model 480 、 9700 、 2400 热循环仪的使用。当使用不同型号的循环仪或检测仪器时位点间的平衡性会有微小差别。在不同的 310 分析仪中不同荧光标记的相对检测效率会有差异。 PP16 系统的三种颜色在某些仪器上是平衡的，在另一仪器上（扩增产物同）可能不平衡。 |
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4) 为何使用去离子甲酰胺？
Formamide 保证样本进样之前保持变性状态。甲酰胺的质量可影响电泳结果。
Formamide 长时间可转化为甲酸。 Formamide 中的离子使其导电率超过 100us/cm 时会与 DNA 相互竞争。这样导致峰变低，灵敏度降低。有时用树脂去掉离子实际上会增加导电率降低峰高。 |
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5) 建样品表时是否应包含特别信息？
如果样本信息栏中无单词 Ladder, PowerTyper16 Macro 会显示错误信息，不能完成“ Run Macro” Ladder 信息可在进入 PowerTyper 后加入。具体操作为：选择“ Show Dye/ Lane Window” ( 在“ Views” 下 ) ，点亮样本，在“ Sample Info” 栏中加“ Ladder ”。 |
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6) 进样最佳时间？
2-5 秒。根据不同仪器进一步优化，通常在优化过程中以 3 秒为起点。峰高应在 1000RFU 左右。 |
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7) 为什么样本基线升高了？
可能是由于使用别的仪器的 Matrix, 或用不同标记物做的 Matrix 。通常推荐用适宜的标记来产生 Matrix 。另外峰高太高（超过 2000RFU ）也会抬升基线。可以改变分析软件中分析参数来使剪掉的最小峰高增加至 50RFU 。另外减少 DNA 扩增模板用量。 |
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8) 在 377 胶上有红色背静条纹，为什么？
“红色”的产生是由于板子远离扫描窗或有油污。建议用 2N NAOH 洗板。若不能改善问题，可用 2N HCL 洗净。 |
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9) 每个样本中都有一个低峰？
这可能是由于 310 中的 block 需清洗，用消毒水清洁 block ，同时 buffer 也用消毒水配制以免细菌产生。 |
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10) 在 CXR Ladder 中有额外的峰，为什么？
由于 TMR 标记串至 CXR ，当样本峰高很高时会发生。也许是由于平衡每种标记时仪器间的不同引起。 |
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11) 当处用 GenePrint Powertyper 16 Macro 时，为什么会有“无足够记忆”的错误？
初装 Genetyper 软件，需配制更大的 memory ，具体操作为：关程序，点亮 Genetyper 程序文件，在 Apple 下面，选择“ get infor” 点亮 memory 。额外的 memory 可加在程序中。 |
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12) 在 PowerTyper 中分析数据时无 ILS 数据？
用 Genetyper2.5 时需在“ edit” 下改变参数，以便加入兰，绿，黄，红色。 |
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13) PowerTyper 未为可见峰作分型标记？
是由于峰高低于分析参数中所设的峰域值。 |
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14) Ladder 中的等位基因未被标出？
内标未正确定义可错误标记 Ladder 。需在分析软件中重新定义内标。 |
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15) 为什么会有“ off ladder alleles”？
原因有二。毛细管电泳时样本的迁移会有微小变动，这是由于温度或毛细电泳柱有变化，而位点的碱基对大小是按第一个进入分型软件的 ladder 标记的。故建议在一系列样本中用两个 ladder 。在 377 中，胶中的不均匀也会产生此现象，故建议每个胶板中用两个 ladder. 。另一个原因是由于内标定义错误。 |
